krátký úvod k mikroskopu

Přesto, že se technika mikroskopů stále intenzivně vyvíjí, tak základní struktura a části mikroskopů zůstávájí velmi podobné, Proto si můžeme ukázat jednotlivé základní části mikroskopu na příkladu mikroskopu fy. Carl Zeiss z roku 1908. Základem mechanické konstrukce je stativ, který nese další části a určuje jejich vzájemnou pozici. Mikro a makrometrický posuv navzájem proti sobě posunují stolek a objektiv. Právě jemný posun objektivů vůči preparátu mikrometrickým šroubem umožňuje přesné zaostření preparátu. Stolek mikroskopu je opatřen mechanismem dovolujícím přesné nastavení pozice v preparátu. Nejrošířenějsí je pravoúhlý - křížový posun preparátu. Objektivy jsou namontovány v nosiči objektivů - revolveru který umožňuje rychlou výměnu objektivů pouhým otočením. Vlastní revolver je namontován na tubusu, který jej spojuje s okulárem, centruje je navzájem do jedné osy a určuje jejich vzdálenost - tubusovou délku (viz. níže). Podobně pohyblivě je ke stativu mikroskopu připojen i kondenzor. Posun kondenzoru ve vertikálním směru umožňuje nastavení jeho správné pozice vůči preparátu a objektivu, která je klíčová pro správné nastavení osvětlení. Objímka kondenzoru obvykle umožňuje v malém rozsahu pohyb v horizontální rovině, tak aby jsme mohli vycentrovat kondenzor vůči ose objektivu. Součástí kondenzoru je i aperturní clona umístěná pod kondenzorem. Pod kondenzorem je osvětlovač - v tomto případě velmi jednoduchý tvořený pouze zrcátkem odrážejícím do kondenzoru světlo z externího zdroje.

Rozdíl výše uvedené konstrukce vůči moderním badatelským mikroskopům je hlavně v integraci širokého spektra vybavení (osvětlovač, zařízení pro různé techniky pozorování, dokumentační zařízení) do těla mikroskopu. Výrazně se také změnilo ergonomické uspořádání jednotlivých prvků. Stále častěji se objevují motorizované prvky (revolverový nosič objektivů, nosič fluorescenčních bloků, mikrometrický šroub,...) a s nimi související obslužné elektronické obvody, v některých případech umožňující komunikaci s dalšími zařízeními (PC, externí ovládací jednotky,...)

podrobnější informace o aktuálních mikroskopech lze nalést na stránkách výrobců:

Optické části mikroskopu:

Objektiv: objektiv vytváří reálný obraz preparátu, který je dále zvětšován okulárem. Na vlastnostech objektivu záleží kvalita obrazu, který v okulárech uvidíme. Charakteristickými parametry každého objektivu jsou: Zvětšení objektivu - je charakteristikou, která se výrazně projeví na celkovém zvětšení mikroskopu. U většiny je zvětšení objektivu označeno také barevným proužkem na bázi válce objektivu Numerická apertura - NA - je velmi důležitým parametrem objektivu, udávajícím schopnost přijímat paprsky vstupující do čelní (frontální) čočky pod určitým úhlem. Na numerické apertuře závisí další parametry objektivu, jako je rozlišovací schopnost a hloubka ostrosti. Pracovní vzdálenost - vzdálenost mezi frontální čočkou objektivu a preparátem. Závisí na typu objektivu, zvětšení a NA - viz tabulka. optická korekce a zvětšení NA pracovní vzdálenost (mm) ACH 10x 0.25 6.10 ACH 20x 0.40 3.00 ACH 40x 0.65 0.45 ACH 60x 0.80 0.23 ACH 100x (Oil) 1.25 0.13 PL 4x 0.10 22.0 PL 10x 0.25 10.5 PL 20x 0.40 1.20 PL 40x 0.65 0.56 PL 100x (Oil) 1.25 0.15 PL FL 4x 0.13 17.0 PL FL 10x 0.30 10.00 PL FL 20x 0.50 1.60 PL FL 40x 0.75 0.51 PL FL 100x (Oil) 1.30 0.10 PL APO 1.25x 0.04 5.1 PL APO 2x 0.06 6.20 PL APO 4x 0.16 13.00 PL APO 10x 0.40 3.10 PL APO 20x 0.70 0.65 PL APO 40x 0.85 0.20 PL APO 60x (Oil) 1.40 1.10 PL APO 100x (Oil) 1.40 0.10

• Achromatické objektivy (achromáty) - jsou nejčastěji používaným typem objektivů s nejnižší úrovní korekce. Mají barevnou vadu korigovanou pro červenou a modrou barvu. Kulová vada je korigovaná pro zelenou (k té jsou naše oči nejcitlivější). Jsou vhodné pro běžné pozorování, ale ne tak docela pro barevnou fotografii. Nejlepší výsledky při černobílé fotografii získáme použitím zeleného filtru. Na objektivu se tato úroveň korekce neoznačuje - objektivy bez označení jsou achromatické.
  Planachromatické objektivy mají upravené sklenutí zorného pole.
  
  
• Apochromatické objektivy (apochromáty) - jsou typem objektivu s nejlépe korigovanými vadami. Barevná vada je tradičně korigována pro červenou, zelenou a modrou, kulová vada pro dvě z těchto barev. U některých moderních objektivů mohou korekce zahrnovat dokonce ještě větší množství barev. V důsledku své konstrukce mají apochromáty při daném zvětšení vysokou NA (viz. tabulka). Ta se projeví jasnějším obrazem a vyšším rozlišením, které lze těmito objektivy dosáhnout.
  Planapochromatické objektivy - S úrovní korekcí roste složitost konstrukce a tím i cena objektivů. Proto se tento typ optiky objevuje pouze u kvalitních mikroskopů, určených pro mikrofotografii, pro kterou jsou velmi vhodné.
  
  
• Fluoritové objektivy (semi-apochromáty, fluority) - jak už naznačuje název jsou korekcí svých vad umístěny mezi achromáty a apochromáty. Jejich název fluority souvisí s kazivcem (fluoritem), který byl původně používán k výrobě jejich některých čoček. Představují obvykle cenově dostupnější řešení než apochromáty s velmi dobrou úrovní optických parametrů.
  Planfluority - korekce na ploché zorné pole

optická tubusová délka (referenční fokální vzdálenost) - starší objektivy byly zpravidla konstruovány tak, aby v určité vzdálenosti za objektivem (optická tubusová délka) vznikal reálný obraz objektivem vytvořený. Tato vzdálenost se lišila podle výrobce (Zeiss - 160mm, Meopta, Leica - 170mm).
U moderních objektivů se stále častěji objevuje korekce do nekonečna (infinity correction) V tomto případě nevzniká obraz za objektivem v nějaké konkrétní vzdálenosti, ale až v určité vzdálenosti za tubusovou čočkou, za níž vzniká jakási obdoba výše zmiňované tubusové délky vzhledem k níž jsou umístěny okuláry. Mezi zadní čočkou objektivu a tubusovou čočkou, tak vzniká prostor, kterým paprsky probíhají "rovnoběžně". Výsledkem je, že délku tohoto prostoru můžeme velmi snadno měnit, například vkládáním přídavných zařízení, aniž bychom narušili optickou konstrukci mikroskopu.

mechanická tubusová délka - udává vzdálenost mezi nosičem objektivů (sedlem závitu, do kterého zašroubujeme objektiv) a koncem tubusu, do kterého zasunujeme okulár.

tloušťka krycího skla - může výrazně ovlivnit kvalitu obrazu u "suchých" objektivů s vyšší numerickou aperturou (0,4). Proto jsou tyto objektivy korigovány pro určitou tloušťku krycího skla - standardně 0,17mm. U některých objektivů s vysokou numerickou aperturou proto bývá korekční kroužek, umožňující variabilní nastavení tloušťky krycího skla.

parfokalita objektivů - je jednou z důležitých vlastnotí objektivů v sadě. Je to stálá vzdálenost mezi bazí objektivu a zaostřeným preparátem (délka objektivu + pracovní vzdálenost). Praktickým dopadem je, že pokaždé když otočením revolveru změníme objektiv můžeme pouze mikrometrickým šroubem lehce doostřit, protože jsme opět v rovině ostrosti, nebo její blízkosti.

imerzní objektivy - velikost numerické apertury závisí na indexu lomu prostředí před frontální čokou objektivu. Pokud je tímto prostředím vzduch ("suché objektivy"), tak se paprsky vystupující z preparátu lámou od kolmice a menší část jich vztupuje do objektivu. Hodnota NA suchých objektivů tak může nejvýše dosáhnout 0,9.
Pro dosažení vyšší numerické apertury je třeba spojit frontální čočku objektivu s krycím sklem preparátu látkou s výšším indexem lomu - imerzí. Obvykle se používá imerzní olej (max dosažitelná NA=1,4), glycerol nebo voda
Objektivy určené k použítí s imerzí jsou obvykle na povrchu označeny příslušným imerzním médiem - Imerzní olej (OIL, OEL nebo HI); voda (w), Glycerol (glyc).

Okulár

Okulár zvětšuje obraz vytvořený objektivem a podílí se tak na celkovém zvětšení obrazu. Může pouze zvětšit detaily zobrazené objektivem, ale nemůže zobrazit více, než obsahuje původní obraz. Užitečné zvětšení okulárů, tak má svou horní mez. Podle jednoduchého pravidla by celkové zvětšení nemělo přesáhnout asi 1000 násobek numerické apertury objektivu. Další zvětšování obrazu nevede k rozlišení dalších detailů a často bývá označováno jako prázdné zvětšení.

Označení, která najdeme na okulárech se liší podle výrobce, ale obvykle zahrnují:

zvětšení - např. 10x

typ okuláru - podle konstrukce se rozlišují dvě základní skupiny okulárů:

pozitivní - clona okuláru je je pod čočkami okuláru
negativní - clona je uvnitř, mezi čočkami okuláru

Konstukčně jednoduchý je negativní Huygensův okulár. Je složený ze dvou ploskovypuklých čoček obrázených vypouklou stranou k objektivu. Tento typ se často nachází u jednodušších typů mikroskopu s achromatickými objektivy. Clonka objektivu je umístěna mezi čočkami, kde vzniká obraz. Právě na clonku se proto umisťují mřížky pokud je potřebujeme použít.

Dalším jednoduchým typem je Ramsdenův okulár. Je to pozitivní okulár, jehož dvě ploskovypouklé čočky jsou vypuklou stranou obrázeny k sobě. Clonka je umístěna pod spodní čočkou. Měřítka a mřížky se opět kladou na tuto clonku.

Výrazně komplikovanější konstrukce, ale i lepší optické parametry najdeme u periplanatických okulárů (jinak také nazývány periskopické, ortoskopické nebo komplanatické). Jedná se o negativní okuláry s clonou (kam umisťujeme mřížky) uvnitř okuláru. Tento typ okulárů má obvykle také výrazně vyšší číslo zorného pole, takže vytváří dojem blíže umístěného širšího zorného pole příjemného pro pozorování.

Konstrukce okulárů může korigovat některé vady objektivu. Kompenzační okuláry mohou korigovat např. barevnou vadu (jejich barevná vada je inverzní k vadě objektivu) a sklenutí pole. Charakteristika kompenzace vad okulárem musí odpovídat charakteristice objektivu. Protože se konstrukce a strategie kompenzace objektiv-okulár liší mezi jednotlivými výrobci, je vhodné použít pro dosažení optimálních výsledků okuláry doporučené výrobcem objektivu.

použití brýlí - u některých okulárů je možné pozorovat s nasazenými brýlemi díky větší vzdálenosti výstupní pupily (Ramsdenův disk, bod oka, místo, kde se protínají paprsky vystupující z okuláru, sem by mělo být umístěno oko, aby jsme viděli celou šířku zorného pole) od očnice (oční čočka, čočka, kterou se díváme do mikroskopu). Standardní vzdálenost výstupní pupily od očnice bývá okolo 10mm, kdežto u okulárů pro pozorování s brýlemi to může být okolo 20mm. Tyto okuláry mají širokou oční čočku a bývají označeny symbolem brýlí, H nebo HE (high eyepoint).

velikost zorného pole = FN / (zvětšení objektivu x tubusový faktor)
Př.: 0,662 mm = FN (26,5) / (40 x 1)

dioptrická korekce - součástí některých okulárů, obvykle jednoho v páru, bývá koreční prstenec umožňující rozdílné nastavení obou okulárů, tak aby vyhovovali rozdílům mezi pravým a levým okem pozorovatele. Toto dioptrické nastavení se také používá k zaostření mřížek (měřítka, zaostřovací mřížka) vložených do obrazové roviny okuláru.

kondenzor

Je soustava čoček koncentrujících světlo přicházející z osvětlovače do kužele osvětlujícího preparát. Pro vznik kvalitního obrazu v mikroskopu je stejně důležitý jako ostatní optické části.

Stejně jako u objektivu je u kondenzoru důležitou charakteristikou numerická apertura. V případě kondenzoru je ale NA funkcí úhlu paprsků které z kondenzoru vystupují. NA u suchých kondenzorů dosahuje, podobně jako u objektivů, maximální hodnoty 0,9. Pokud má být dosaženo vyšší numerické apertury, tak je třeba spojit vrchní čočku kondenzoru s podložním sklem imerzí a můžeme dosáhnout, podle konstrukce kondenzoru, až NA 1,4. K nastavení omezení numerické apertury podle podle potřeb pozorování a charakteru objektivu je určena aperturní clona umístěná pod kondezorem.
S vyšší numerickou aperturou kondenzoru je spojena menší plocha, kterou je kondeznor schopen homogenně osvítit. Kondenzory s vysokou numerickou aperturou tak nejsou schopny homogenně osvítit cele zorné pole slabších objektivů (4x; 2x; 1,25x). Pro použití s těmito objektivy jsou vhodné kondenzory s nižší numerickou aperturou, nebo kondenzory u nichž lze modifikovat optické vlastnosti například odklopením vrchní čočky (swing-out kondenzory).

Vzhledem ke konstrukci je nejjednodušší Abbeho typ kondenzoru. Je složený ze dvou nebo tří čoček a nejsou u něj korigovány ani barevná ani kulová vada. Aplanatický kondenzor má korigovanou kulovou vadu (pro zelenou barvu). Aplanaticko-achromatický kondenzor má korigovanou barevnou i kulovou vadu a je nejvhodnější pro náročné práce. S úrovní korekce samozřejmě roste i složitost konstrukce.

Konstrukce kondenzoru může být specificky modifikována pro některé pozorovací techniky (např. pozorování v temném poli).

Další informace:

http://micro.magnet.fsu.edu/primer/index.html - Molecular expresions - Optical Microscopy Primer - asi nejobsáhlejší on-line zdroj

http://www.mwrn.com - WWW information source on microscopes and microanalysis - dobrý rozcestník

http://las.perkinelmer.com/content/livecellimaging/index.asp - realtime confocal microscopy