základní principy optiky

základní principy optiky v mikroskopii

Základním elementem optické části světelného mikroskopu jsou čočky. Obvykle skleněné prvky, jejichž povrchové plochy, ať už různě zakřivené nebo rovné, jsou zodpovědné za ohyb světla. Právě ohyb světla - refrakce - je jevem který stojí za schopností měnit dráhu paprsků, kterou využíváme při zvětšování objektů jednoduchou čočkou (spojkou), nebo složeným mikroskopem. Jev lze také pozorovat velmi jednoduše při sledování objektů ponořených ve vodě. Odtud úsloví "hůl do vody ponořená, zdá se býti nalomená". Při refrakci dochází k ohybu paprsků na rozhraní dvou prostředí, které se liší rychlostí jakou se v nich světlo pohybuje. U paprsků dopadajících jinak než kolmo na povrch rozhraní mezi těmito prostředími, tak vzniká rozdíl mezi úhlem dopadu a úhlem pod kterým procházejí paprsky prostředím.

Pokud světlo proniká z prostředí ve kterém se světlo šíří vyšší rychlostí (např. vzduch) do prostředí s rychlostí nižší (voda) dochází k lomu paprsků ke kolmici (normále). Pokud je tomu naopak, lámou se paprsky od kolmice. Velikosti obou úhlů jsou ve vzájemné závislosti, kterou vyjadřuje následující rovnice:

index lomu (a) x sin (úhel dopadu) = index lomu (b) x sin (výsledný úhel)

Pro vyjádření změny rychlosti světla v daném prostředí se používá index lomu - n, který udává poměr rychlosti světla ve vakuu (3x10⁸ m/s) a rychlost světla v daném médiu. Příklady indexů lomu různých prostředí:

vzduch	1,0003
voda	1,333
křemenné sklo	1,520
olovnaté sklo	1,656
diamant	2,4217
imerzní olej	1,515
glycerol	1,473

Změna směru při průchodu rozhraním mezi dvěma optickými prostředími závisí na rychlosti kterou se světlo v daném prostředí pohybuje (na rozdílu mezi prostředími) a vlnové délce. Na jednom rozhraní tedy dochází k různému ohybu různých vlnových délek. Výsledkem je rozklad světla na hranolu, nebo vznik duhy na obloze. Tento efekt je také spojený s barevnou vadou.

Pokud paprsky dopadají kolmo na povrchy oboustranně planární (planparalelní) desky, nedochází k jejich ohybu a procházejí nezměněny. Podobný efekt má i průchod touto deskou, pokud paprsky dopadají pod určitým úhlem, zde však už dochází k posunu obrazu.

Pokud ovšen nejsou strany rovnoběžné, tak dochází k ohybu paprsků, který je typický pro čočky. Podle toho jakým způsobem jsou broušeny povrchy čoček, tak spojují, nebo rozptylují paprsky. Právě podle tvaru povrchu se rozeznávají dva základní typy čoček:

spojky (pozitivní, zvětšující čočky) - mají konvexní povrchy, spojují paprsky rovnoběžně vstupující do čočky (kolmo k hlavní rovině) do ohniska. Ohnisko se nachází na hlavní ose čočky v ohniskové vzdálenosti od centra (hlavní roviny) čočky.
rozptylky - mají konkávní povrchy a paprsky přicházející rovnoběžbě rozptylují.

Kombinací planárních, konvexních a konkávních ploch vznikají další typy čoček. Podrobnější informace jsou například na těchto stránkách - http://micro.magnet.fsu.edu/primer/lightandcolor/lensesintro.html

Pro vytvoření zvětšeného obrazu můžeme použít jednoduchou čočku (spojku). Pokud umístíme objekt mezi dvojnásobek ohniskové vzdálenosti a ohnisko, tak získáme zvětšený, převrácený, skutečný obraz, který můžeme zachytit na příklad na stínítko, film, nebo čip.

skutečný, zvětšený obraz

Pokud umístíme obraz ještě blíže k čočce, do vzdálenosti menší než je vzdálenost ohnisková, tak získáme zvětšený, nepřevrácený a neskutečný obraz, který se zdá být na straně objektu (pozorujeme jej skrze čočku - lupu). Na rozdíl od skutečného obrazu je pozorovatelný okem.

neskutečný, zvětšený obraz

U složeného mikroskopu jsou ke zvětšení objektu (preparátu) použity v principu dva optické systémy - objektiv a okulár.
Objektiv (název odvozená od jeho blízkosti k objektu) vytváří skutečný, zvětšený a převrácený obraz objektu, který pozorujeme a dále zvětšujeme okulárem. Skutečný obraz vytvořený objektivem je vlastně dalším objektem jehož neskutečný a zvětšený obraz pozorujeme okulárem . Obraz vytvořený objektivem vzniká ve střední obrazové rovině, která je v určité vzdálenosti od zadní ohniskové (fokální) roviny objektivu a nachází se blízko konce tubusu (obvykle asi o 10mm níže) v místě, kde je umístěna vnitřní clona okuláru. Tato vzdálenost se nazývá optická tubusová délka. Okuláry jsou konstruovány tak, aby neskutečný obraz, který sledujeme, vznikal asi 25cm od oka pozorovatele.

Celkové zvětšení objektu pozorovaného mikroskopem je tedy výsledkem zvětšení objektivem a následně okulárem. Zvětšení, kterého dosahují mikroskopické objektivy se obvykle pohybuje v rozmezí 1x - 100x. Tohoto zvětšení je dosaženo právě velmi malými ohniskovými vzdálenostmi objektivů. Zvětšení okulárů se pohybují mezi 5x - 30x, obvykle se pro pozorování používají okuláry 8x - 15x zvětšující. Prakticky můžeme celkové zvětšení spočítat vynásobením těchto dvou faktorů zvětšení, ke kterým se obvykle přidává ještě tzv. tubusový faktor - koeficient vyjadřující jak se na celkovém zvětšení podílí optické komponenty mezi objektivem a okulárem.

celkové zvětšení = zvětšení objektivu x zvětšení okuláru x tubusový faktor

Například kombinací objektivu 20x zvětšujícího a 10x zvětšujícího okuláru dostaneme při tubusovém faktoru = 1,25 celkové zvětšení 250x. Podle toho co je napsáno výše by se mohlo zdát, že je možné libovolně kombinovat okuláry a objektivy a dosáhnout tak velkého zvětšení. Samozřejmě tomu tak není. Smysl má pouze zvětšení, které nám ukáže nové detaily. Další zvětšování obrazu vede pouze k tzv. prázdnému zvětšení, které žádnou novou informaci nepřináší. Hranice mezi užitečným a prázdným zvětšením je daná rozlišením objektivu a to je zase závislé na numerické apertuře a vlnové délce použitého zvětla. Jako hodnotu dosaženého rozlišení používáme minimální vzdálenost dvou bodů, které ještě rozlišíme jako dvě oddělená individua. Pro dosažení maximální rozlišovací schopnosti je kritické správné nastavení optického systému mikroskopu. Vztah mezi rozlišením (R), numerickou aperturou (NA) a vlnovou délkou (l) se obvykle vyjadřuje Rayleighovou, nebo od ní odvozenými rovnicemi.

R = 0.61l/NA
R = 1.22l/(NA(objektivu) + NA(kondenzoru)) - zohledňuje numerickou aperturu objektivu i kondenzoru

dosažitelné rozlišení u běžných typů objektivů při střední vlnové délce 550nm

	Plan achromáty		Plan Fluority		Plan Apochromáty
	NA	R (nm)	NA	R (nm)	NA	R (nm)
4x	0.10	2750	0.13	2120	0.20	1375
10x	0.25	1100	0.30	920	0.45	610
20x	0.40	690	0.50	550	0.75	370
40x	0.65	420	0.75	370	0.95	290
60x	0.75	370	0.85	320	0.95	290
100x	1.25	220	1.30	210	1.40	200

Z tabulky je zřejmé, že odhad maximálního dosažitelného rozlišení je v tomto případě asi 0,2 mm. Tuto hodnotu můžeme ještě o něco snížit použitím kratších vlnových délek (např. při NA=1,4 a l=400nm je R=174,2 nm). Obecně lze ale říci, že při použití běžných technik světelné mikroskopie můžeme rozlišit dva body (objekty) vzdálené alespoň 0,2mm. Zdravé lidské oko je bez pomoci externí optiky schopno rozlišit body o vzdálenosti přibližně 200mm, tedy přibližně 1000x méně. Právě 1000násobné zvětšení se tedy pohybuje blízko hranice užitečného zvětšení pro systém s rozlišením 0,2 mm. Pro zjednodušení určení hranice se obvykle používá "palcové" pravidlo - celkové zvětšení by nemělo přesáhnout 1000-násobek numerické apertury objektivu.

optické vady:

Chod paprsků na jednoduchých čočkách bohužel úplně neodpovídá výše uvedeným optickým principům, ale je zatížen některými vadami.
Jsou to hlavně následující:

vada kulová (sférická aberace) - paprsky dopadající rovnoběžně s optickou osou na čočku se nelámou do ohniska a nesbíhají se zde v jediném bodě, ale "ohnisko" se liší podle vzdálenosti od optické osy. Čím dále od optické osy, tím více se paprsky lámou. Vniká tak namísto bodu celá plocha (kaustika). Příčinou je kulové zakřivení lomných ploch - čím zakřivenější a vypuklejší, tím výraznější je vada. Důsledkem je, že obraz není stejně ostrý na všech místech a na místo ostrého bodu se v obraze objeví malá ploška (bod s rozptylovými kruhy).

vada barevná (chromatická aberace) - je důsledkem toho, že čočka při průchodu bílého světla láme paprsky různých vlnových délek různě. Ohniska a tím i zvětšení pro jednotlivé barvy se liší. Delší vlnové délky (např. červená) mají ohnisko dále od čočky, než vlnové délky kratší (např. modrá). Vzniká tedy několik různě velikých barevných obrazů v různých vzdálenostech. Důsledkem je nejasný obraz s barevnými obrysy.

vyklenutí zorného pole - obraz rovinného objektu kolmého na optickou osu není planární ale tvoří kulovou plochu. Důsledkem je, že v okulárech vidíme pouze část této roviny ostře - buď zaostříme střed nebo periferii obrazu. Tento problém není kritický při pozorování objektu očima (stále proostřujeme), ale znemožňuje získání v celé ploše ostrých mikrofotografií.

zkreslení (distorze) obrazu - provází sklenutí pole a projevuje se různým zvětšením objetů na periferii a ve středu obrazu.

astigmatismus - u paprsků dopadajících šikmo (mimo optickou osu) na čočku se bod předlohy v obraze jeví jako elipsa nebo úsečka. Vada narůstá s úhlem odklonu obrazových paprsků od hlavní osy. (interaktivní demonstrace na Molecular Expresions Microscopy Primer)

Odkazy a literatura:

http://micro.magnet.fsu.edu/primer/lightandcolor/index.html - velmi pěkná interaktivní učebnice

http://acept.asu.edu/PiN/rdg/readings.shtml - populárně základy optiky

http://www.licha.de/AstroWeb/articles_fullsize.php3?iHowTo=16 - o rozlišení a Airyho discích

http://webtop.msstate.edu/ - interaktivní cvičení pro demonstraci některých optických jevů