Klonování a mutageneze
in silic(i)o
Úkol:
- Identifikujte homology genu SEC13 z kvasinky Saccharomyces
cerevisiae v Arabidopsis.
- Pro zvolený gen připravte fiktivní objednávku cDNA
a disrupčních mutantů z veřejně přístupných sbírek.
- Pro zvolený gen zjistěte základní údaje o expresi
z veřejně dostupných transkriptomických dat.
Postup:
Identifikace „sondy“
- Otevřete link na NCBI
Entrez, zvolte typ databáze (protein) a zadejte
klíčová slova SEC13
a Saccharomyces.
-
Otevřete jeden z několika odkazů na sekvenci proteinu
Sec13p a prohlédněte si získaný soubor. Pak vyberte zobrazení ve formátu
FASTA
a stiskněte Display.
-
Získanou sekvenci zkopírujte do textového souboru
v Notepadu.
Vyhledání rostlinných homologů sondy
- Otevřete link na NCBI
Blast a zvolte prohledávání nukleotidové databáze proteinovou sondou Protein
query - Translated db [tblastn].
-
Vložte sekvenci sondy do velkého okénka. Zvolte v
Options vpravo (Select from) Organism = Arabidopsis
thaliana a odešlete dotaz příkazem BLAST.
-
Po uplynutí přiměřené doby zformátujte a prohlédněte
výstup.
-
Vyhledejte a zapište locusID 2 nejbližších homologů SEC13.
Vyhledání dostupných cDNA, EST a T-DNA insercí
- Otevřete link na SIGNAL
a vstupte do menu T-DNA Express.
-
Zadejte locusID do kolonky Gene Name a spusťte
stisknutím Submit. Objeví se klikací barevná
mapa lokusu i s okolím, z níž jsou dostupné sekvence cDNA a rozhraní T-DNA
i další údaje. Informace o dostupnosti cDNA či osiva (liší se podle barevného
kódu) jsou naspodu stránky s mapou i s odkazy.
-
Prozkoumejte vybrané odkazy na cDNA a inserce.
Příprava fiktivní objednávky
- Zvolte některou cDNA ze sbírky RIKEN
a vyhledejte ji v katalogu. Seznamte se se strukturou
stránek a systémem elektronického objednávání (nabídka Ordering).
Sledujte proces objednávky tak daleko, jak daleko vás server pustí bez registrace
- Vyberte v katalogu některou T-DNA z veřejné sbírky ABRC
a sledujte proces objednávky tak daleko, jak daleko vás server pustí bez registrace.
Analýza genové exprese
- Otevřete link na NASCArrays
a prohlédněte si nabídku nástrojů.
- Vyvolejte nástroj SpotHistory a zadejte LocusID
vybraného genu; program vyhledá sondy přísluěející genu na všech čipech. V
případě, že gen je přítomen na více čipech nebo má více sond, vyberte z následující
nabídky aspoň jednu možnost. V histogramu klikněte některou hodnotu a prozkoumejte
seznam experimentů, v nichž tato hodnota byla naměřena. Prozkoumejte zejména
extrémní hodnoty.
- Vyvolejte nástroj GeneSwinger. Zadejte stejný
gen a vyberte sondu či čip jako v předchozím případě. Výstupem prohledávání
je seznam experimentů seřazený podle míry variability exprese zkoumaného genu.
Co vypovídají tyto a předchozí výsledky o možné biologické funci zkoumaného
genu?
Další zdroje
Nápověda:
Pro přístup na T-DNA Express a Genevestigator používejte
Explorer, ne Netscape či Firefox.
Formát dat
FASTA:
>jméno sekvence, případně komentář,
a pak následuje
SEKVENCEAMINOKYSELINCINT...
Převedení sekvence do formátu FASTA: např. programem SMS
nebo ručně.
Terminologie genů
gi|12345678 – unikátní ID v GenBank/EMBL
systému
At1g23450 – locus ID v genomu arabidopsis
gb|BAA123456 – GenBank Accession
Hodnocení výsledků programu BLAST:
E-value – čím nižší, tím lépe
– zhruba znamená pravděpodobnost náhodného dosažení tejné míry sekvenční
podobnosti. E-value vyšší než 0.05 bývá většinou artefakt.