Příprava mikroskopických preparátů

 

Většinu rostlinných objektů je třeba před pozorováním mikroskopem nějakým způsobem upravit. Chceme-li pozorovat vnitřní uspořádání souvislého pletiva, je třeba často zhotovit řezy pletivem nebo je "projasnit", tak abychom mohli sledovat jeho vnitřní uspořádání. Pro pozorování povrchů nám mohou pomoci otiskové preparáty (repliky). Jednotlivé buňky můžeme z pletiva uvolnit chemickou nebo enzymatickou macerací. Způsobů úpravy pletiva existuje velké množství a pro podrobnější informace mohou být dobrým zdrojem níže uvedené publikace.

V některých případech můžeme pozorovat živé pletivo (vitální preparáty). Právě živé buňky pletiva nám mohou poskytnout informaci o skutečně nativním stavu. Zároveň ale dynamický systém živé buňky stále odpovídá na okolní podněty (např. podmínky pozorování), mění se v čase a podléhá zkáze. Proto se často používá postupů preparace vedoucích k "polotrvalým" nebo trvalým preparátům. Jejich předností je "trvanlivost", schopnost poskytovat více nebo méně věrný obraz o pletivu (buňce) v době fixace.

 

Standardní postup pro přípravu trvalých preparátů může vypadat následujícím způsobem:

příprava trvalých preparátů obvykle vyžaduje následující kroky:

  1. fixace
  2. odvodnění
  3. infiltrace zalévacím médiem
  4. zalití do média
  5. řezání
  6. žehlení a lepení na sklíčka
  7. barvení
  8. uzavírání

 

Po odběru je pletivo určené pro přípravu trvalých preparátů fixováno (viz kapitola o fixaci). Tento krok by měl umožnit zachování charakteru pletiva co nejblíže jeho nativnímu stavu a omezit změny materiálu vyvolané manipulací s ním během dalšího zpracování.
Pro označení objektů během jejich zpracování jsou vhodné cedulky z tvrdšího papíru popsané obyčejnou tužkou. Ta se na rozdíl od inkoustů per a fixů nerozpouští. Cedulky je vhodné vložit přímo k objektům do nádobek použitých na fixaci. Mohou tak snadno provázet objekty během dalších kroků až k jejich zalití do média. Většina fixativ vyžaduje vyprání z objektu před dalším zpracováním. K vyprání je vhodné použít pufr, nebo roztok použitý během fixace, samozřejmě bez fixativa.
Většina trvalých preparátů jsou řezové preparáty a právě příprava řezů a s ní související činnosti bývají obvykle časově nejnáročnější z celého postupu. Pro dosažení dostatečně tenkých řezů se obvykle používá opora zalévacího média, pevné matrix, do které je objekt uzavřen. Médium objekt tedy pouze neobklopuje, ale zcela jej prostupuje. Mezi nejčastěji používané z široké palety zalévacích médií patří parafín, syntetické pryskyřice (někdy označované jako plastik) a Steedmanův vosk. Většina z těchto materiálů není příliš hydrofilní, nebo je dokonce výrazně hydrofóbní. Pro úspěšné prosycení objektu zalévacím médiem je nutné jej zbavit vody - dehydratovat jej.

Odvodnění (dehydratace):
Tento krok by měl být efektivní, ale zároveň šetrný. Právě během dehydratace dochází často k nejvýraznějším objemovým změnám a deformaci objektů. Odvodnění objektu lze v principu provést dvěma způsoby.
Nejobvyklejší je použítí postupné odvodňovací řady. Při převádění objektů sérií roztoků s rostoucí koncentrací organických rozpouštědel (např. etanolu, acetonu) dojde k postupnému "vyředění" vody v objektu.

Nejastěji používanou je alkoholová (etanolová) odvodňovací řada:
stupeň - % etanolu ve vodném roztoku
I - 30%
II - 50%
III - 70%
IV - 90%
V - 96%
VI - 100%
VII - 100%
VIII - 100%
  • začátkem řady je stupeň s koncentrací vody odpovídající koncetraci vody v použité fixáži (např. po FAA s 50% etanolu začínáme od kroku II).
  • doba po kterou mají být objekty v jednotlivých krocích odvodňovány závisí na charakteru a velikosti objektů. U malých dobře prostupných objektů (např. kořenové špičky) jsou dostatečné 1-2 hodinové intervaly. U objektů kompaktnějších a větších je třeba čas patřičně prodloužit (až 24h).
  • 100% (bezvodý) etanol si můžeme snadno připravit odvodněním prodávaného 96% etanolu za použití molekulárních sít, nebo vyžíhané modré skalice

 

butanolová odvodňovací řada:
stupeň
% EtOH
% ButOH
% vody
I
20
10
70
II
25
15
60
III
30
25
45
IV
30
40
30
VI
25
55
20
VII
20
70
10
VIII
15
85
0
IX
0
100
0
  • použití této řady je vhodné před infiltrací a zaléváním do parafínu, protože butanol je, narozdíl od etanolu, rozpouštědlem parafínu
  • začátkem řady je stupeň s koncentrací vody odpovídající koncetraci vody v použité fixáži (např. po FAA s 50% etanolu začínáme od kroku III).
  • doba po kterou mají být objekty v jednotlivých krocích odvodňovány závisí na charakteru a velikosti objektů. U malých dobře prostupných objektů (např. kořenové špičky) jsou dostatečné 1-2 hodinové intervaly. U objektů kompaktnějších a větších je třeba čas patřičně prodloužit (až 24h).
  • 100% (bezvodý) butanol si můžeme snadno připravit odvodněním prodávaného butanolu
  • Většina autorů doporučuje použití t-butanolu (terciárního). V naší laboratoři se rutině používá n-butanol (sekundární,normální). Výhodou oproti t-butanolu je, že nekrystalizuje při teplotách blízkých laboratorní teplotě (teplota tání t-butanolu je 25-26°C)

Alternativou je rychlé odvodnění v jednom kroku některými organickými rozpouštědly (methyl-cellosolve, dymethoxypropan, triethyl fosfát) (podrobnosti a postup viz O'Brien a Mccully, 1981 nebo Ruzin, 1999)

 

Infiltrace a zalití do média:
Vlasní infiltrace zalévacím médiem by měla zajistit homogenní prosycení celého objemu objektu zalévacím médiem. Během infiltrace je rozpouštědlo média postupně nahrazováno čistým médiem - dochází k úplnému vyředění rozpouštědla. Úplné odstranění rozpouštědel je podmínkou úspěšného zalití. Zbytky rozpouštědla mění vlastnosti média (rozměklý parafín, špatná polymerizace pryskyřice), které se výsledně nepříjemně projeví při řezání a jsou proto nežádoucí. Jediným spolehlivým způsobem jak tomu zabránit je poskytnout inlfitraci dostatečný čas.

Většina rozpouštědel používaných při dehydrataci obvykle není rozpouštědlem parafínu. Proto je nutné před infiltrací parafínem zařadit tzv. intermédium - rozpouštědlo parafínu (xylen, butanol, isopropanol, Histo-Clear, ) umožňující jeho difůzi do objektu během infiltrace. Aplikace intermédia může být v jednom kroku po dehydrataci, nebo může být součástí odvodňovací řady (např. etanol-butanolová řada).