Fluorescenční mikroskopie


Fluorescence je fyzikální jev při kterém molekuly některých látek absorbují světelné záření určité vlnové délky (excitace) a část energie kterou tímto způsobem získá ve velmi krátkém čase (femtosekundy, 10-15s) opět vyzáří (emise) v podobě světla o delšíší vlnové délce, tj. s nižší energii a jinou barvou. Tento posun ve vlnové délce (Stokesův posun) souvisí s ztrátou části energie jinými, nefluorescenčními, procesy (uvolnění tepla, rezonanční přenos na okolní molekuly a podobně). Jako příklad je na obrázku uvedeno excitační (absorbční) a emisní spektrum FITC (fluorescein 5-isokyanát). Rozdíl mezi absorbčním a emisním maximem odpovídá právě Stokesovu posunu. Z grafu je také patrné, že intenzita absobce excitačního záření, tak i fluorescenční emise jsou závislé na vlnové délce. Absorbční a emisní spektrum fluorescenční látky jsou také ovlivňovány podmínkami prostředí, jako je pH, koncentrace některých iontů, nebo konjugace s jinými molekulami.

 

Fluorescenční mikroskopie je v současné době široce rozšířený přístup jak v rostlinné tak živočišné histologii a buněčné biologii. Intenzivní rozvoj v nedávno minulých i současných letech stále přináší nové postupy pro detekci struktur, organel nebo jednotlivých molekul. Jedním z hlavních důvodů častého využití fluorescenční mikroskopie je její vysoká citlivost. Fluoreskující molekuly mohou být detekovány již při velmi malých koncentracích. Zdrojem této vysoké citlivosti je vysoký kontrast vůči pozadí. U fluorescence obvykle máme jasný (světlý) signál na temném pozadí. Toho je dosaženo použitím dvou filtrů, které nám oddělí na základě vlnových délek excitační a emisní záření (viz vedlejší obrázek). Excitační filtr vymezuje rozsah vlnových délek použitých pro excitaci. Naopak emisní (bariérový) filtr umožňuje vydělit část spektra ředstavující hlavně požadovaný signál. Právě jejich kombinace obou fitrů určuje efektivní minimalizaci signálu pozadí, který pak nepřekrývá vlastní fluotrescenční signál. Ten je následně dobře čitelný i při nízké úrovni. K dosažení srovnatelného kontrastu absorbcí, která se projeví pozorovatelnou změnou barvy nebo jasu po průchodu světla strukturou (např. při pozorování v procházejícím světle) je třeba výrazně vyšší koncentrace detekované látky nebo pigmentu. S vysokou citlivostí souvisí také možnost používat výrazně nižší koncentrace detekčních činidel a méně tak ovlivňovat cílovou strukturu např. cytotoxickým působením barviva. Tento bod je obvzláště důležitý při pozorování živých buněk.

U látek které jsou sami o sobě schopné fluorescence mluvíme o primární fluorescenci (autofluorescenci). Fluorescenci můžeme také vyvolat navázáním fluorescenčního barviva nebo sondy na nefluorescenční cíl a indukujeme tak sekundární (nepřímou) fluorescenci. Látky které jsou fluorescence schopné a které používáme k fluorescenčnímu barvení se označují jako fluorochromy. Často jsou konjugované do komplexu fluorescenční sondy s dalšími složkami, např. krátkými řetězci nukleových kyselin nebo protilátkami, které specifikují jejich interakci s cílovými molekulami a strukturami. Chemickou strukturou jsou fluorochromy obvykle organické látky s aromatickými kruhy a delokalizovanými elektrony schopnými excitace.

Intenzita fluorescenčního signálu je výsledkem spolupůsobení různých faktorů. Je to síla řezu (objektu) a koncentrace fluorochromu v této struktuře. Koncentrace barviva v objektu odráží jednak množství barvitelného materiálu, ale často také postup a dobu barvení. Extinkčním koeficient vyjadřuje množství záření, které barvivo přijme při dané koncentraci a tlouštce řezu (objektu). Je závislý na vlnové délce (viz. graf absorbce uvedený výše). Jaké část přijatého záření bude transformována na emitované záření udává kvantová efektivita barviva. U většiny běžných fluorochromů se kvantová efektivita pohybuje okolo 30%. Může však být výrazně ovlivněna podmínkami prostředí a blednutím fluorochromu (photobleeching). Výsledkem součtu těchto faktorů je, že pouze velmi malé množství světelné energie, které dopadá na preparát, je transformováno na fluorescenční signál. U objektů se silnější odezvou to může být poměr mezi dopadajícím a emitovaným zářením 10-4 - 10-6 u technik s nízkým signálem (např. in situ hybridizace, některé postupy imunolokalizace) může tento poměr být ještě o několik řádů nižší např. 9-10 - 10-10.

 

Fluorescenční mikroskop

Z výše uvedeného je zřejmé, že pro dosažení pozorovatelného signálu a dostatečného kontrastu musí být funkční fluorescenční mikroskop schopen jednak koncetrovat dostatečnou energii excitačního záření na objekt, a na druhé straně efektivně filtrovat - oddělit excitační a emisní záření. Pro pozorování fluorescence se dnes používá v podstatě pouze epifluorescenční mikroskop, jehož schéma je na dalším obrázku. Fluorescence v procházejícím světle je používána pouze vyjímečně.

Jako zdroj světla pro fluorescenční mikroskopii se obvykle používají vysokotlaké výbojky. Obloukový výboj mezi elektrodami představuje intenzivní bodový zdroj světla vhodný pro pro osvětlení zadní ohniskové roviny objektivu. Používají se buď rtuťové, nebo xenonové výbojky. Rtuťové výbojky jsou vysokotlaké skleněné trubice naplněné parami rtuti mezi dvěma elektrodami. Při napětí zhruba 600V dochází k ionizaci těchto par a obloukovému výboji. Podobně fungují i xenonové výbojky. Rozdíly jsou ve zdrojích - Hg výbojky jsou napájeny střídavým proudem, kdežto Xe výbojky používají usměrněné zdroje o vyšším napětí. Dalším rozdílem jsou spektra (na dalším obrázku) emitovaného záíření. Xenonové výbojky maji homogenější rozložení, bez výrazných píků, naopak nemají menší zastoupení v UV oblasti.


obrázky byly převzaty z materiálů fy. Olympus


Vzhledem k vysokému vnitřnímu tlaku plynů ve výbojce a extrémním teplotám, kterých dosahují, jsou výbojky v mikroskopu umístěny do lampové skříně, která by měla zabránit úrazu v případě exploze výbojky. Eliminuje také únik záření výbojky do prostředí mimo osvětlovač mikroskopu. To je velmi důležité, protože krátkovlné UV záření může při intenzitě poskytované výbojkou vážně poškodit oči. Výbojky mají omezenou životnost. Pro rtuťové výbojky je životnost udávaná výrobcem obvykle 200h, u xenonových několik set hodin. Většina výbojek je funkční i po překročení této doby, může ale docházet k poklesu světelné intenzity a navíc se zvyšuje ryziko exploze výbojky.
V poslední době se stále častěji, hlavně v konfokální mikroskopii, používají jako zdroje fluorescenčního záření lasery.


Kolektor osvětlovače přenáší světlo z oblouku výbojky do sady fluorescenčních filtrů, odkud pokračuje do objektivu a na objekt. Součástí kolektoru je obvykle také tepelný filtr, odstraňující dlouhovlnné záření (obvykle delší než 800nm), které by mohlo způsobit nadměrné zahřívání pozorovaného objektu.
Součástí osvětlovače je také závěrka (shutter). Jejím otevřením a uzavřením mohou uživatelé regulovat průchod světla osvětlovačem a tím i dobu excitace objektu (její omezení je důležité třeba pro redukci blednutí fluorochromu) ale i pro omezení nebezpečného krátkovlnného záření do okolí (viz. výše). Intenzitu záření pro excitaci můžeme regulovat pomocí ND (neutral density) filtrů vkládaných do slotu pro filtry v osvětlovači.
Podobně jako o procházejícího světla i zde můžeme nastavit chod paprsků osvětlovacím systémem polní a aperturní clonou. Efekt aperturní clony je zde ale jiny než je tomu v modu procházejícího světla, protože dopadající záření se přímo nepodílí na vzniku pozorovaného obrazu, ale dává vznik fluorescenci. Zdroje fluorescence pak můžeme považovat za samostatné zdroje záření, které pozorujeme.
Oddělení excitačního a emisního záření zajišťuje sada fluorescenčních filtrů. Filtry jsou uspořádány spolu s dichroickýcm zrcadlem do bloku ("fitrblok", "fluorescenční kostka"). Excitační filtr vymezuje část spektra použitou pro excitaci daného fluorochromu. Naopak část spektra emitovanou fluorochromem vymezuje emisní filtr, který buď určuje pouze spodí limit propouštěných vlnových délek, nebo orčuje obě hranice části spektra. Další částí bloku je dichroické zrcadlo umístěné zde pod úhlem 45°. Toto tenké skleněné zrcadlo má schopnost odrážet světlo určitého rozsahu vlnových délek a naopak propouštět vlnové délky jiné. S vysokou efektivitou (~90%) tak m;6e odrážet excitační záření do objektivu a naopak propouštět (~90%) emisní záření z objektivu do okulárů.Podrobnější informace o filtrech a sadách fluorescenčních filtrů lze nalést na stránkách výrobců uvedených níže.

U epifuorescenčních mikroskopů (episkopické osvětlení, fluorescence v dopadajícím světle) je objektiv používán jako zároveň jako osvětlovací prvek - kondenzor. Hlavními výhodami je využítí vyšší numerické apertury objektivu pro osvětlení (vyšší intenzita) a snadné nastavení systému.

  1. Jedním z klíčových kroků při optimalizaci fluorescenčního mikroskopu pro pozorování je nastavení pozice výbojky.
  2. skontrolovat zda je zavřený shutter
  3. zapnout zdroj výbojky a zařadit fluorescenční kostku s delší vlnovou excitace (zelená - WG). Nevhodné je použít UV excitaci protože budete pozorovat přímo excitační záření. Je dobré také zařadit ND filtr a snížit tak působení intenzivního zdroje světla na oči.
  4. zařadit malé zvětšení (2-4x) nebo prázdný otvor nosiče objektivů
  5. na stolek vložit kartičku papíru (šikovná je vizitka)
  6. zaostřit kolektorem epifluorescenčního osvětlovače elektrody a světelný oblouk výbojky
  7. pokud je osvětlovač výbavený zrcátkem za výbojkou (při mírně rozcentrované výbojce se objeví dva obrazy oblouku mezi elektrodami), tak seřídit polohu zrcátka tak aby oba obrazy byly stejně intenzivní
  8. překrýt oba obrazy ve tředu pole tak, aby vznikl homogenní světlý bod
  9. roztáhnout kolektorem tak aby světelný zdroj vyplnil celé zorné pole



Odkazy a literatura



http://www.becker-hickl.de/Fluorescence%20Lifetime%20Imaging%20Microscopy.htm - Fluorescence Lifetime Imaging

http://flosun.salk.edu/fluo.html - tabulka fluorochromů
http://www.zeiss.de/C12567BE0045ACF1/allBySubject/2FAB489B0E6FAF79C1256A1400425394 - další rozsáhlá tabulka fluorochromů s doporučenou kombinací filtrů
http://fluorescence.bio-rad.com/ - databáze fluorochromů

 


http://www.chroma.com/ - výrobce filtrů, na stránkách je ke stažení hezký přehled funkce a principu filtrů v pdf

http://www.omegafilters.com - výrobce filtrů,