Fázový kontrast


Jedním z častých problémů při pozorování biologických objektů v mikroskopu bývá nízký kontrast bránící rozlišení objektů a jejich struktury . Pro lidské oči je kriteriem kontrastu rozdíl jasu nebo barvy objektu vůči pozadí. Odlišné zbarvení a jas objektu vzniká při průchodu světla jeho absorbcí přirozenými pigmenty v objektu (viz obrázek níže). Malé rozdíly v absorbci vedou k malým rozdílům jasu (amlitudě) a zbarvení (změna složení světla selektivní absorbcí některých vlnových délek). Je také možné uměle zvýšit pigmentaci, a následně kontrast, barvením objektu. Další možností je využití "optických" metod. I při průchodu "nebarevným" objektem dochází ke změnám procházejícího světla a to i přesto, že tyto změny nejsme schopni pozorovat přímo, bez pomoci dalších zařízení. S jinou povaha materiálu objektu obvykle souvisí i jiný indexem lomu objektu vůči okolnímu prostředí. Změna indexu lomu se projeví změnou dráhy paprsků na rozhraní dvou prostředí, ale také posuvem fáze procházejícího světla (viz obrázek níže). Těchto změn využívají některé mikroskopické techniky ke kontrukci obrazu o dostatečném kontrastu, který můžeme sledovat.

- při průchodu homogenním prostředím nedochází ke změně paramatrů procházejícího světla - fáze i amlituda se nemění

- při průchodu objektem, neliší se indexem lomu, dochází k absorbci světla a změně jeho amplitudy (v porovnání s prvním připadem), která se projeví změnou v intenzitě (jasu). Obvyklejší je, že průchod světla objektem provází i změna fáze.

- objekt je transparentní, nedochází k absorbci světla (změně v amplitudě a jasu), ale rozdíl v indexu lomu způsobí posun fáze vlnění (srovnej podle svislých čar)

 

Fázový kontrast

Fázový kontrast umožňuje transformaci fázové změny na změnu amplitudy. Princip fázového kontrastu popsal F. Zernike v roce 1950 (v roce 1953 mu za tento objev byla udělena Nobelova cena). Uspořádání částí mikroskopu pro fázový kontrast je na dalším obrázku.
Mimo optické komponenty pro pozorování ve světlém poli jsou zde ještě dvě "fázové desky" umístěné do optické dráhy mikroskopu. První, umístěná v kondenzoru mikroskopu, vymezuje dutý kužel světla dopadající na objekt. Vytváří se tak v podstatě dvě hlavní optické dráhy. První, osvětlující objekt a beze změny procházející preparátem v místě bez objektu (na obrázku žlutá barva) a druhý, procházející objektem, jehož dráha a fáze je ovlivněna právě průchodem objektem. Rozdíl těchto dvou optických drah odráží různé indexy lomu objektu a jeho okolního prostředí. Při průchodu objektem obvykle dojde ke spoždění fáze o méně než 1/4l , tento posun nejsme schopni detekovat očima. Tuto fázovou změnu lze převést na změnu amplitudy (jasu), pokud posuneme fázi světla, které prošlo beze změny preparátem v místě bez objektu (osvětlení pozadí objektu) o 1/4l pomocí fázové desky v objektivu a následnou interferencí paprsků těchto dvou optických drah ve střední obrazové rovině. Pokud došlo ke zpoždění světla pozadí o 1/4l , tak se světlo pozadí dostává do stejné fáze jako světlo po průchodu objektem a jejich následnou pozitivní interferencí ke zvýšení jasu objektu pozorovaného na tmavším pozadí (negativní fázový kontrast). To je dobře patrné vzhledem k relativně nízké intenzitě osvětlení pozadí omezené fázovým prstencem kondenzoru a často ještě potlačené neutrálním šedým (ND) filtrem, který je součástí fázového prstence fázové desky objektivu.
Naopak, pokud dojde na fázové desce ke zpoždění fáze světla po průchodu objektem, tak je výsledkem rozdíl 1/2l mezi oběma optickými drahami. Výsledkem je destruktivní intreference ve střední obrazové rovině a tmavší objekty na světlém pozadí (pozitivní fázový kontrast)

Jedním z typických artefaktů vznikajících při pozorování ve fázovém kontrastu je "halo efekt" ohraničující objekty. Tmavé objekty jsou v pozitivním fázovém kontrastu ohraničeny světlým "stínem" a naopak jasné objekty v negativním fázovém kontrastu mají "stín" tmavý. Tento efekt je výsledkem neúplného prostorového oddělení optických drah světla pozadí a světla procházejícího objektem. Část světla po průchodu objektem sdílí optickou dráhu se světlem pozadí i během průchodu fázovou deskou objektivu a dochází tak k posunu fáze odlišnému od ostatního světla procházejícího objektem. Výsledkem je právě vznik "halo" na hranicích objektu.

 

Diferenciální Interferenční Contrast

Podobně jako fázový kontrast i diferenciální interferenční kontrast (DIC) využívá pro vznik viditelného (amplitudového) obrazu rozdíly v indexech lomu prostředí, objektu, nebo jeho jednotlivých komponent. Obvykle se používá k pozorování drobných nebarvených objektů. Podle obvykle používané kontrukce, kterou navrh Nomarski a u níž je Wolastonův hranol umístěn nad objektivem a není přímo jeho součástí, se také často nazývá Nomarského DIC. Obraz pozorovaný v DIC je výsledkem



Odkazy a literatura