Přednáška z Anatomie a fyziologie rostlin
| datum |
12.3.2013 |
| přednáší |
Mgr. Karel Doležal, Dr. (Univerzita Palackého, Olomouc) |
| název |
Pokroky v analýze cytokininů
|
| anotace |
Cytokininy jsou důležitou skupinou rostlinných hormonů; hrají nezastupitelnou úlohu v kontrole růstu a vývoje rostlin. Bylo zjištěno, že i malá změna v chemické struktuře těchto N6-substituovaných derivátů adeninu může vézt k dramatickým změnám v jejich biologické aktivitě.
Analýza endogenních cytokininů v rostlinném materiálu je problematická zejména z důvodu jejich extrémně nízkých endogenních koncentrací (u mnoha metabolitů zpravidla pod 1 pmol na gram čerstvé hmoty) a složitosti rostlinné matrice. Rychlý technologický vývoj v posledních letech se nevyhnul ani hmotnostní spektrometrii a přinesl zásadní změny i do analýzy rostlinných hormonů; poprvé umožnil například kvantifikaci cytokininů v miligramových množstvích pletiva. Na našem pracovišti jsme vyvinuli novou UPLC-ESI(+)MS/MS metodu pro rychlé a extrémně citlivé stanovení cytokininů v rostlinných extraktech. Tato metoda využívá spojení ultra-účinné kapalinové chromatografie (AcquityTM UPLC,Waters) s trojitým quadrupolem (XevoTM TQ MS, Waters) vybaveným ionizací elektrosprejem. Pro každý stanovovaný analyt byly optimalizovány podmínky kvantifikace v MRM modu. Zcela nedávno jsme také prezentovali pravděpodobně první metody pro přímou identifikaci kvantifikaci cytokininových nukleotidů (mono-, di- a trifosfáty, první cytokininy biosyntetické dráhy) pomocí HPLC–MS a CE-MS.
Avšak pro stanovení endogenních cytokininů vyskytujících se ve femtomolárních koncentracích v relativně velmi komplexních extraktech je třeba účinných separačních a purifikačních technik. Proto je v poslední době našim hlavním cílem další miniaturizace naší současné metody izolace cytokininů tak, aby postup byl použitelný pro vzorky o velikosti 1-5 mg rostlinného materiálu a menší. Pro tento účel jsme výrazně modifikovali jak extrakci na pevné fázi (SPE), tak následnou imunoafinitní chromatografii (IAC). SPE je nově prováděna na mikrokolonách sestavených v pipetovací špičce, StageTip (STop And Go Extraction Tip), a kombinována se vsádkovou imunopurifikací za použití skupinově-specifických monoklonálních protilátek imobilizovaných na chitosanem pokrytých nanočásticích magnetitu.V tomto uspořádání se jedná o rychlou, relativně levnou, jednoduchou, zároveň ale robustní izolační mikrometodu s vysokou propustností, která v kombinaci s vylepšenou rychlou chromatografickou separací a citlivou a selektivní hmotnostně spektrometrickou detekcí poskytuje velmi účinný nástroj pro analýzu cytokininů.
On-line LC-EC/ESI-MS se ukázala být rychlým a jednoduchým přístupem k modelování vybraných oxidačních reakcí cytokininů a jejich derivátů. Produkty reakcí v elektrochemické cele (dealkylace, hydroxylace, vznik dimeru) byly následně identifikovány pomocí hmotnostní spektrometrie při vysokém rozlišení. Nově vznikající deriváty s potenciálně velmi zajímavou biologickou aktivitou mohou být touto metodou také izolovány a dále studovány.
|
| materiály |
životopis přednášejícího (PDF)
pozvánka (PDF)
|
|
|
