PROTOPLASTY

Úvod:

Co jsou protoplasty?

Protoplasty jsou buňky (rostlin, hub nebo bakterií), které byly zbaveny buněčné stěny. Odstranit buněčnou stěnu lze mechanicky, nebo štěpením pomocí enzymů. Příkladem enzymů štěpících složky buněčné stěny jsou celulázy, štěpící celulózu v rostlinných buněčných stěnách, nebo pektinázy, které degradují pektinovou složku buněčných stěn.

Buňky zbavené buněčné stěny zaujímají kulovitý tvar a jsou obaleny pouze membránou. Protože jsou velmi citlivé vůči prostředí, zvláště jeho osmotickým vlastnostem, je třeba protoplastování i následnou kultivaci protoplastů provádět v prostředí s vysokou osmotickou aktivitou, jako např. v roztoku cukru. V čisté vodě by došlo k popraskání protoplastů vlivem plazmoptýzy.

Příčný řez listem - buňky mezofylu s chloroplasty a buňky pokožky.
Uvolněné protoplasty mezofylových buněk.

Protoplasty jsou dále využívány pro mnoho účelů. Například, dva protoplasty lze přinutit k fůzi, přičemž vzniká hybridní buňka s vlastnostmi obou buněk „rodičovských“. Protoplasty lze také transformovat vybranými geny například pomocí elektroporace nebo pomocí infekce geneticky modifikovanou bakterií Agrobacterium tumefaciens. Kultivací na vhodném kultivačním médiu lze z jednoho protoplastu opět regenerovat celistvou rostlinu.

Protoplasty lze izolovat z celé řady pletiv, z listů, stonků, kořenů, květů, a dokonce i z pylu. Metoda izolace a kultivační média se liší podle druhu rostliny a pletiva, ze kterého mají být protoplasty izolovány.

K čemu je využíváme na našem praktiku?

Rostlinné buňky mají různé tvary, přičemž tvar rostlinné buňky je udržován pomocí buněčné stěny. Po odstranění buněčné stěny zaujímá rostlinný protoplast kulovitý tvar, a teprve po regeneraci nové buněčné stěny může buňka opět získat nejrůznější tvary. Důležitost buněčné stěny v udržování tvaru buněk bude demonstrována na buňkách mezofylu listu salátu. Studenti budou mít možnost porovnat tvar buněk mezofylu před protoplastováním a po něm.


Technické informace:

Potřeby:

Trvalý preparát příčný řez listem salátu

Čerstvý list salátu

Enzymový koktejl, 1ml (2% driseláza* v 0,7 M mannitolu).

21% sacharóza, 1ml

eppendorfka

plastová Petriho miska

žiletka

pinzeta

pipeta

košíček z tkaniny s 10 μm otvory

buničitá vata

krycí a podložní mikroskopická skla

* Driseláza je enzymová směs izolovaná z hub. Obsahuje polysacharidové exo- a endohydrolázy, jako například celulázu, pektinázu, beta-xylanázu atp.


Experiment 1: příprava protoplastů

Začněte s tímto experimentem, protože příprava protoplastů zahrnuje 40-minutovou inkubaci, během které můžete provádět další experimenty.

  1. Nařežte na plastové misce kousek listu salátu (cca 1cm 2) na přibližně 1-2 mm čtverečky.
  2. Přeneste nařezaný list ihned do eppendorfky s 1ml enzymového koktejlu.
  3. Inkubujte při mírném třepání v teplotě 28°C 40 minut.
  4. Po 40 minutách odpipetujte opatrně roztok z eppendorfky (nenabírejte do pipety celistvé kousky pletiva) a přeneste tekutinu do košíčku s 10 μm otvory v tkanině.
  5. OPATRNĚ a POMALU odsajte část média z košíčku tak, aby v něm stále zbývalo trochu tekutiny. Otvory ve dně košíčku jsou příliš malé na to, aby dnem protoplasty prošly, proto zůstávají protoplasty v tekutině v košíčku.
  6. Připipetujte do košíčku opatrně 1 ml 21% sacharózy a opět většinu tekutiny opatrně odsajte.
  7. Zbytek tekutiny s protoplasty z košíčku naberte do pipety (cca 200 μl) a přeneste do čisté eppendorfky.
  8. Pozorujte protoplasty po mikroskopem. Protoplasty jsou velice křehké, proto krycí sklo vždy podložte dalšími dvěma krycími skly. Vznikne tak komůrka, ve které protoplasty nejsou rozmačkány krycím sklem, a kde můžete protoplasty dobře pozorovat pod mikroskopem (viz nákres).

 

Textové pole: Nákres: zhotovení preparátu pro pozorování protoplastů pod mikroskopem.

Experiment 2: pozorování tvarů buněk listu salátu

  1. Pozorujte pod mikroskopem trvalý preparát příčného řezu listem salátu. Nakreslete typ a tvar buněk, které vidíte.
  2. Pomocí pinzety stáhněte kousek pokožky čerstvého listu salátu. Umístěte ihned do kapky destilované vody na podložním sklíčku a přikryjte krycím sklem. Pozorujte pod mikroskopem a nakreslete typ a tvar buněk, které vidíte.

Experiment pro zájemce: co se stane s protoplasty, pokud je místo v osmoticky vyrovnaném médiu budete kultivovat ve vodě?

  1. Kápněte na podložní sklo roztok s protoplasty a přikryjte krycím sklem, které je podloženo dalšími dvěma krycími skly.
  2. Pipetou pomalu z jedné strany preparátu přikapávejte vodu, a na druhé straně odsávejte médium kouskem buničité vaty. Tímto způsobem dojde k výměně média na preparátu za vodu.
  3. Najděte v mikroskopu protoplasty a sledujte plazmoptýzu (praskání) protoplastu vlivem nadměrného příjmu vody.

Úkol:

  1. Připravte protoplasty z čerstvého listu salátu.
  2. Pozorujte pod mikroskopem buňky mezofylu z příčného řezu listem salátu, buňky pokožky listu salátu, a protoplasty. Popište rozdíly ve tvaru buněk. Popište rozdíly ve tvaru mezofylových buněk před a po protoplastováním. Vysvětlete.
  3. (Jen pokud bylo prováděno) Vysvětlete, co se stalo s protoplasty, pokud bylo kultivační médium vyměněno za čistou vodu.

Příklady pozorování a vysvětlivky: