Klonování a mutageneze in silic(i)o 

---

Úkol:

• Identifikujte homology genu SEC13 z kvasinky Saccharomyces cerevisiae v Arabidopsis.
• Pro zvolený gen připravte fiktivní objednávku cDNA a disrupčních mutantů z veřejně přístupných sbírek.
• Pro zvolený gen zjistěte základní údaje o expresi z veřejně dostupných transkriptomických dat.

Postup:

Identifikace „sondy“

1. Otevřete link na NCBI Entrez, zvolte typ databáze (protein) a zadejte klíčová slova SEC13 a Saccharomyces.
2. Otevřete jeden z několika odkazů na sekvenci proteinu Sec13p a prohlédněte si získaný soubor. Pak vyberte zobrazení ve formátu FASTA a stiskněte Display.
3. Získanou sekvenci zkopírujte do textového souboru v Notepadu.

Vyhledání rostlinných homologů sondy

1. Otevřete link na NCBI Blast a zvolte prohledávání nukleotidové databáze proteinovou sondou Protein query - Translated db [tblastn].
2. Vložte sekvenci sondy do velkého okénka. Zvolte v Options vpravo (Select from) Organism = Arabidopsis thaliana a odešlete dotaz příkazem BLAST.
3. Po uplynutí přiměřené doby zformátujte a prohlédněte výstup.
4. Vyhledejte a zapište locusID 2 nejbližších homologů SEC13.

Vyhledání dostupných cDNA, EST a T-DNA insercí

1. Otevřete link na SIGNAL a vstupte do menu T-DNA Express.
2. Zadejte locusID do kolonky Gene Name a spusťte stisknutím Submit. Objeví se klikací barevná mapa lokusu i s okolím, z níž jsou dostupné sekvence cDNA a rozhraní T-DNA i další údaje. Informace o dostupnosti cDNA či osiva (liší se podle barevného kódu) jsou naspodu stránky s mapou i s odkazy.
3. Prozkoumejte vybrané odkazy na cDNA a inserce.

Příprava fiktivní objednávky

1. Zvolte některou cDNA ze sbírky RIKEN  a vyhledejte ji v katalogu. Seznamte se se strukturou stránek a systémem elektronického objednávání (nabídka Ordering). Sledujte proces objednávky tak daleko, jak daleko vás server pustí bez registrace
2. Vyberte v katalogu některou T-DNA z veřejné sbírky ABRC a sledujte proces objednávky tak daleko, jak daleko vás server pustí bez registrace.

Analýza genové exprese

1. Otevřete link na NASCArrays a prohlédněte si nabídku nástrojů.
2. Vyvolejte nástroj SpotHistory a zadejte LocusID vybraného genu; program vyhledá sondy přísluěející genu na všech čipech. V případě, že gen je přítomen na více čipech nebo má více sond, vyberte z následující nabídky aspoň jednu možnost. V histogramu klikněte některou hodnotu a prozkoumejte seznam experimentů, v nichž tato hodnota byla naměřena. Prozkoumejte zejména extrémní hodnoty.
3. Vyvolejte nástroj GeneSwinger. Zadejte stejný gen a vyberte sondu či čip jako v předchozím případě. Výstupem prohledávání je seznam experimentů seřazený podle míry variability exprese zkoumaného genu. Co vypovídají tyto a předchozí výsledky o možné biologické funci zkoumaného genu?

Další zdroje

• The Arabidopsis Information Resource - TAIR
• cDNA a disrupce lze vyhledávat i přímo programem blastn na NCBI
• Brána k anotovanému genomu Arabidopsis na serveru TIGR.
• Genevestigator - databáze a systém na analýzu transkriptomických dat (pro školy a výzkum zdarma, ale vyžaduje registraci).

Nápověda:

Pro přístup na T-DNA Express a Genevestigator používejte Explorer, ne Netscape či Firefox.

Formát dat

FASTA:

>jméno sekvence, případně komentář, a pak následuje
SEKVENCEAMINOKYSELINCINT...

Převedení sekvence do formátu FASTA: např. programem SMS nebo ručně.

Terminologie genů

gi|12345678 – unikátní ID v GenBank/EMBL systému
At1g23450 – locus ID v genomu arabidopsis
gb|BAA123456 – GenBank Accession

E-value – čím nižší, tím lépe – zhruba znamená pravděpodobnost náhodného dosažení tejné míry sekvenční podobnosti. E-value vyšší než 0.05 bývá většinou artefakt.